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引物合成及荧光定量QPCR

服务介绍:

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种以PCR反应为基础的DNA定量技术,通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量,从而达到对目的基因的定性和定量分析。现有两种常用的方法对PCR产物进行荧光定量:一种是利用荧光染料与双链DNA结合,通过荧光强度进行荧光定量;另一种是利用携带了荧光报告基因的特异性DNA探针对目标基因进行定量。
常用荧光染料有:SYBR GreenⅠ、EvaGreen、LC Green等
Taqman荧光探针作为定量检测的首选,是一种寡核苷酸,充当DNA复制的起点,荧光基团连接在探针的5'末端,淬灭剂连接在3'末端。PCR扩增时加入引物和探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,探针酶切降解,报告荧光基团与淬灭荧光基团分离,荧光信号被系统检测接收,每扩增一条DNA链伴随一个荧光分子形成,实时荧光信号的累积与PCR产物同步进行,实现实时定量的实验结果。相对于SYBR荧光染料具有序列特异性,直结合到互补区的强灵敏度。相较于杂交探针,其只需设计一条探针,既方便也能完成定量PCR要求。

实验结果展示:

引物设计实验流程:

获得游离5,-羟基→合成DNA原料→带帽(capping)反应→转化为稳定磷酸三酯→重复步骤4
探针引物设计实验流程:
目的基因查找比对→探针与引物设计→合成

荧光定量QPCR实验流程:
取材→RNA提取逆转录成cDNA→实时荧光定量PCR-(QPCR产物电泳)→数据分析

引物设计样品运输要求:

基因名称和种属、或已知探针引物序列、或基因ID号
荧光定量QPCR送样运输要求:
组织、细胞:-80℃保存,干冰运输;
血液:EDTA抗凝管,4℃运输;
RNA样本:体积≥10 μL,干冰运输。
 

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