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磷酸化蛋白质组学

目    录
  • 产品介绍
  • 常见问题
  • 经典案例
  • 结果展示

背景简介 
蛋白质发生翻译后修饰时其分子质量会发生相应的改变,通过质谱能够精确测定蛋白质或多肽的分子质量。蛋白质磷酸化是一种非常重要且广泛存在于原核生物和真核生物中的翻译后修饰调控方式, 参与细胞的增殖、发育、分化、凋亡,细胞骨架调控、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等。由于磷酸化修饰的蛋白质在生物样本中含量低、动态范围广,利用定量蛋白组学分析手段对富集得到的磷酸化肽段样品进行定量分析前,需要对修饰进行富集从而提高修饰蛋白丰度。通过蛋白定量技术和修饰富集技术相结合,可对样本中翻译后修饰进行相对定量,筛选差异修饰位点和差异修饰蛋白。
   
技术优势 
全面性:以整个细胞所有蛋白为研究对象,囊括了细胞内所有具有生命功能的蛋白
可靠性:可一次性全面检测不同蛋白激酶及磷酸化酶对同一个蛋白磷酸化程度的影响,
因而结果更加普遍性和可靠性
高效性:磷酸化蛋白质组学反映的是细胞内真实发生的事件,考虑了各种变量,
克服了经典生物学中逐步添加变量的缺陷,更为高效
探索性:磷酸化蛋白质组学以细胞内全部蛋白质为研究对象,相对于传统的生物学研究
以及蛋白质芯片,更易发现未知的新磷酸化位点和磷酸化蛋白质
 
技术路线 


 
分析内容 
 
 
样本类型 
蛋白样品:1mg以上
组织样品:植物组织样本200mg以上,
血液样品1ml以上(血浆注意用EDTA防凝),
尿液2ml,动物组织样品至少1g,
细胞样品为5X107个细胞,
酵母、微生物等干重200mg

 

磷酸化蛋白质组揭示昼夜节律调控机制
Phosphorylation Is a Central Mechanism for Circadian Control of Metabolism and Physiology
研究对象:小鼠肝脏
期 刊:Cell Metabolism
影响因子:18.164
发表单位:马克斯普朗克研究所 
发表时间:2017年1月
研究背景
生物钟,作为生物体内一种无形的时钟,控制着生物体内几乎全部的代谢过程,并且其自身会不断优化以保证生物体的稳态和代谢健康。生物钟节律的紊乱会导致一系列的疾病,如糖尿 病、肥胖和代谢疾病。研究生物钟,在医学上有着重要的意义,并对生物学的基础理论研究起着促进作用。许多研究已经利用转录组和蛋白质组技术研究了昼夜节律,但是磷酸化蛋白质 组尚未涉及。
研究策略
取样策略:小鼠肝脏组织,两天之中每3小时取样一 次,每组4个生物学重复
质谱策略:磷酸化蛋白质组 TiO2富集,Label-free定量技术,Q Exactive HF质谱检测,MaxQuant 搜库
后续验证:转录激活分析 ,Western Blotting 验证
研究结果
1. 体内大规模昼夜磷酸化蛋白质组
小鼠肝脏组织中共鉴定到20,404个磷 酸化肽段,20,076个磷酸化位点, 4,461个磷酸化蛋白,且定量重复性 较高。
 
2. 小鼠肝脏磷酸表达水平每天大幅度振荡
其中27%的磷酸化肽段,41%的磷酸化蛋白表达水平 在2天内发生大幅度变化(图1A)。表达水平聚类分 析,可以将磷酸化肽段分为光照和黑暗两大类(图 1B)。PCA分析表明,磷酸化蛋白质组循环周期为一 天(图1C)。肝脏磷酸化蛋白质富集到不同代谢通 路,表明翻译后修饰在昼夜节律调控中起着关键作用 (图1 D)。
蛋白质表达量和磷酸化蛋白表达量均随昼夜节律振 荡,但是磷酸化蛋白质表达量振荡幅度更大(图 2A,图2B)。蛋白质表达水平平均差异倍数为1.2, 磷酸化蛋白质表达水平平均差异倍数为5倍(图 2C)。FC值累计曲线表明,80%的磷酸化累积强度 来自于20%的磷酸化水平振荡的肽段,表明磷酸化水 平变化的蛋白为调控蛋白而非结构蛋白(图2D)。
 
3. CLOCK蛋白上氨基酸位点的磷酸化循环
小鼠肝脏中CRY1 S588和CRY2 S557分别在 CT0和CT21表达量达到峰值(图3A)。在 CLOCK蛋白上发现了新的磷酸化位点S446和 S440/441,其磷酸化水平也出现周期性的变 化(图3B),这些氨基酸残基位于蛋白质序 列中富含丝氨酸的区域,在哺乳动物中高度保 守(图3C)。CLOCK磷酸化突变体转录活性 低于野生型,然而CRY1介导的转录抑制不受 影响(图3D,图3E)。结果表明,CLOCK蛋 白上的S440 / S441和S446的体内磷酸化循环 在不含CRY1介导的抑制的情况下即可调节其 转录活性。
 
4. 昼夜节律中小鼠肝脏激酶活性调控
激酶富集分析结果表明,ERK底物和AK- T/mTOR底物磷酸化水平在白天和晚上分 别达到峰值(图4A)。与 EGFR-RAS-ERK-RSK级联反应相关的激酶 磷酸化水平在白天达到峰值,这些酶多为 糖酵解,糖原合成和脂肪合成的限速酶, 使得小鼠在食物摄入最少的时候促进糖酵 解提供能量,抑制糖原和脂肪的合成。与 insulin-AKT-mTOR 级联反应相关酶的磷 酸化水平在夜晚达到峰值,此时小鼠活动 活跃,营养充足,使得脂肪合成、生长相 关的代谢途径比较旺盛(图4 B)。


 

功能注释结果图  图中每个圈代表一个数据库的注释结果, 重叠部分代表多个数据库共同注释到的 蛋白, 非重叠部分代表相应数据库单独 注释到的蛋白。


motif 分析图每个样品只显示一个 motif 图,极性 氨基酸(G, S, T, Y, C)显示为绿色,中性氨基酸(Q,N) 显示为紫色,碱 性氨基酸(K, R, H) 显示为蓝色,酸 性氨基酸(D,E)显示为红色,疏 水氨基酸 (A, V, L, I, P, W, F, M)显示为黑色。  


差异蛋白聚类热图纵向是样品的聚类,横向是蛋白聚类, 聚类枝越短代表相似性越高。 从纵向 聚类可以看出样品间蛋白含量的表达模式聚类。


富集有向无环图(Cellular component)图中的比较对顺序和 GO 条目柱状图 中顺序一致。每个方框或圆圈代表一 个 GO term, 放大方框中内容从上 到下代表的含义依次为:GO term 的ID、GO 的描述、GO 富集的 Adjuste dPv、 该GO下差异蛋白的数目/该GO 下背景蛋白的数目。


 

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